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淺談DNA甲基化檢測(cè)-紅外線滅菌器文章
更新時(shí)間:2013-12-18 點(diǎn)擊次數(shù):3852

DNA甲基化是哺乳類動(dòng)物一個(gè)重要的基因外遺傳信號(hào)。有研究表明,DNA甲基化與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生相關(guān),抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的高度甲基化可引起抑癌基因表達(dá)沉默,細(xì)胞出現(xiàn)無(wú)節(jié)制生長(zhǎng),導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前,基因的甲基化研究主要結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和PCR技術(shù),分為甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP)和硫化測(cè)序PCR(Bisulfite sequencing PCR, BSP)。

 

甲基化特異性的PCR(MSP)原理:

     雙鏈DNA變性解鏈后,在HSO3-作用下發(fā)生C→U轉(zhuǎn)化,C若已有甲基化則無(wú)此改變;甲基化修飾只發(fā)生于5′→3′方向C-G相聯(lián)結(jié)構(gòu)的C上,因此在HSO3-作用后,DNA CpG島若無(wú)甲基化,則序列中的改變?yōu)镃→U,CG→UG,若有甲基化則為C→U,CG→CG,用不同的引物做PCR,即可檢測(cè)出這種差異,從而確定基因有無(wú)CpG島甲基化。從理論上說(shuō),DNA發(fā)生甲基化的MSP產(chǎn)物的序列與原序列比較,變化為C→T,CG→CG,相應(yīng)其互補(bǔ)鏈的改變?yōu)镚→A,CG→CG。然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增,zui后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析,確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。MSP法靈敏度較高,應(yīng)用范圍廣。

 

硫化測(cè)序PCR(BSP)原理:

    結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后,用針對(duì)改變后的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。 PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)保持不變。PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)這個(gè)方法能得到特定位點(diǎn)在各個(gè)基因組DNA分子中的甲基化狀態(tài)。

 

甲基化服務(wù)流程:

1)   根據(jù)目的基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物;
2)   基因組DNA的提取和定量;
3)   亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA;
4)   修飾后DNA純化回收;
5)   a、結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR的qMSP;
        b、BSP,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并與未經(jīng)處理的序列比較;
6)   數(shù)據(jù)處理;
7)   向客戶提交數(shù)據(jù)分析結(jié)果與實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

 

樣品要求:

    盡可能新鮮和足量的組織(≥50mg)、細(xì)胞樣品(≥106)或全血(≥300μl),或直接提供純化好的DNA(≥5μg/樣品)。

 

基因甲基化檢測(cè)

    甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過(guò)程.

    DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式,它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因的表達(dá)、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

    CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象,而啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。

    因此,基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在臨床診斷(如甲基化檢測(cè)與低劑量CT相結(jié)合)、藥物敏感性檢測(cè)等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

    目前甲基化特異性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改進(jìn)方法是檢測(cè)基因甲基化的經(jīng)典方法.MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增,zui后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析,確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。
 

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