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非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒操作步驟
更新時(shí)間:2019-03-01 點(diǎn)擊次數(shù):7263

非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒操作步驟

  獸用

【獸藥名稱】

通用名稱:非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒

漢語(yǔ)拼音:Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名稱:African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名稱:無

【主要成分與含量】

 

【作用與用途】  用于血液、血球粉、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。

【用法與判定】

1 用法

1.1 樣品處理

血液樣品直接用;淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品,用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨,再加10.0 mL PBSpH 7.2,含1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素)用MixMax漩渦振蕩器混勻(樣品不足2.0 g1:5比例加PBS),對(duì)處理的待檢樣品置70℃,30分鐘滅活后,3 000 r/min4 ℃離心5分鐘,取上清液,編號(hào)備用;血球粉處理同上,只不過省掉研磨步驟。

1.2 樣品存放

采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24 h;若需長(zhǎng)期保存,須放置-80 ℃冰箱,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。

1.3 操作步驟

1.3.1 病毒DNA的提取(使用A盒)

1)待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和用n表示,取n個(gè)滅菌的1.5 mL離心管,逐管編號(hào)。

2)每管加入Buffer A 500 mL。

3)每管分別加入已處理的待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各200 mL,充分混勻,室溫放置10分鐘。

4)取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管,編號(hào)。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至DNase-Free吸附柱,(為避免堵塞吸附柱,盡量不要吸懸浮雜質(zhì))。

5)用TH-15高速離心機(jī)設(shè)置13000 r/min室溫離心30秒。

6)棄去收集管液體,將吸附柱放回收集管中。

7)吸附柱內(nèi)加入600 μL Buffer B,13000 r/min離心30秒。

8)棄去收集管液體,將吸附柱放回收集管中。

9)重復(fù)步驟(7),(8)。

1013000 r/min空柱離心2分鐘,去除殘留液。

11)將每個(gè)吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中,向柱中央加入50 μL Buffer C,室溫靜置1分鐘,13000 r/min離心30秒,離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液,冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉?/span>DNA須在2 h內(nèi)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,若需長(zhǎng)期保存須放置-80 ℃冰箱,但應(yīng)避免反復(fù)凍融)。

1.3.2 熒光PCR擴(kuò)增(使用B盒)

1)從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、Taq酶,室溫融化后,2 000 r/min離心5秒。設(shè)所需PCR管數(shù)為nn = 樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照),每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要20 μL 熒光PCR反應(yīng)液和0.5 μL Taq酶。計(jì)算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積小管中,充分混合均勻后,向每個(gè)PCR管中各分裝20 μL。

2)分別向上述PCR管中加入1.3.111)中制備的DNA溶液各5μL,蓋緊管蓋,500 r/min 離心30秒。

3)將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi),作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置:

階段,預(yù)變性95/3分鐘

第二階段,95/15秒,52/10秒,60/35秒共45個(gè)循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的60℃延伸時(shí)進(jìn)行。

2 判定

2.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定

閾值設(shè)定原則:根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整,以閾值線剛好超過陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的高點(diǎn)為準(zhǔn)。對(duì)于多通道熒光PCR儀,選定FAM(465-510)檢測(cè)通道讀取檢測(cè)結(jié)果,ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團(tuán)。

2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 陰性對(duì)照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線。

2.2.2 陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

2.2.3 如陰性和陽(yáng)性對(duì)照不滿足以上條件,此次實(shí)驗(yàn)視為無效。

2.3 結(jié)果判定

2.3.1 陰性:無Ct值,且無特征性擴(kuò)增曲線,表明樣品為陰性。

2.3.2 陽(yáng)性:Ct值≤38.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,表示樣品為陽(yáng)性。

2.3.3 Ct值大于38.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品建議復(fù)驗(yàn)。復(fù)驗(yàn)仍出現(xiàn)上述結(jié)果的,判為陽(yáng)性,否則判為陰性。

【注意事項(xiàng)】

1 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少分三個(gè)區(qū):樣品處理區(qū)、反應(yīng)混合物配制區(qū)和檢測(cè)區(qū)。

2 各區(qū)物品均為,不得交叉使用,避免污染。檢測(cè)結(jié)束后,應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。

3 Buffer A有很強(qiáng)的腐蝕性,切勿沾到皮膚或衣服上,否則應(yīng)立即用大量清水沖洗并擦干。

4 在整個(gè)檢測(cè)過程中應(yīng)注意避免交叉污染:提取核酸時(shí)應(yīng)用滅菌的鑷子夾取離心管;對(duì)離心管開蓋時(shí)應(yīng)避免粘在手上或?yàn)R出,否則要立即更換手套。

5 反應(yīng)液在使用前要*融化,并將反應(yīng)液與Taq酶瞬時(shí)離心將液體甩至管底。分裝反應(yīng)液時(shí),應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

6 陽(yáng)性對(duì)照在吸取前應(yīng)在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩12秒。

7 試劑盒中各組分應(yīng)避免反復(fù)凍融。

8 對(duì)樣品及其廢棄物的操作應(yīng)嚴(yán)格遵守生物安全規(guī)定。

9 本試劑盒僅供獸醫(yī)及相關(guān)專業(yè)人士使用。

【貯藏與有效期】  非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒的A盒室溫保存,B盒在-20℃保存,有效期為12個(gè)月。

【規(guī)格】  48檢測(cè)/

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